一、CRISPR-SCREEN简介

CRISPR-SCREEN 又称 sgRNA 文库筛选，或者高通量基因编辑技术。是一种由张锋团队开发的，基于 CRISPR-Cas9 系统，通过构建全基因组 sgRNA 文库同时对多个细胞的不同基因进行编辑，辅助以特定的筛选方案，通过 NGS 测序和生信分析的手段，筛选出符合条件的候选基因。理论上制备靶向全基因组的gRNA文库，运用CRISPR-Cas9就能够高通量的对全基因组的全部基因进行编辑操作，实现高通量的功能性基因的筛选。根据客户的需求，公司提供任意物种的sgRNA文库设计，构建至Broad研究所授权的或客户自行提供的载体中，文库质粒构建和质检的服务；针对可以进行慢病毒包装的质粒还提供各种规格的慢病毒包装服务；另外对于动物细胞，还提供sgRNA文库设计、质粒构建及NGS质检、慢病毒包装、Cas9稳定表达细胞系、大规模细胞筛选实验后NGS测序分析，直至交付客户最终的分析报告的一站式服务！

二、原理流程

1、文库构建流程



2、文库筛选流程

 

 

三、CRISPR-SCREEN应用

1. 药物靶点确定与验证

CRISPR-SCREEN技术可以应用于药物靶点筛选中，通过大规模筛选技术，系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因，从而为疾病治疗提供相关的理论基础。

2. 基因环路上下游调控机制分析

CRISPR-SCREEN技术不仅可以用于编辑人类细胞蛋白编码基因，对于基因组中的调控元件也同样有效，利用这种方法可以对基因环路上下游调控机制进行分析。
 
3. 代谢通路调节机制分析
CRISPR-SCREEN技术可以应用于动植物的代谢通路条件机制分析。
 

4. 病毒侵染宿主细胞的受体蛋白筛选：

通过CRISPR-SCREEN技术可以快速的对病毒侵染宿主细胞的受体蛋白进行筛选和鉴定，科学家就曾通过CRISPR-SCREEN全基因组文库筛选技术，成功发现并证实LDLRAD3蛋白是委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）进入动物和人类细胞的受体，以及筛选出冠状病毒侵入宿主细胞的受体蛋白以及与新冠病毒相关正相关和负相关的重要基因。

四、交付标准



1.sgRNA质粒文库覆盖度可以达到99%以上，NGS测序进行覆盖度、均一性等的检测质控，测序深度300-500X，均一性小于8；

2.文库质粒交付1mg，浓度一般默认1ug/ul以上，酶切后条带单一，纯度90%以上，但是由于是质粒库，有一定几率出现较弱的诡带，这是文库制备阶段无法避免的情况，包病毒会过滤掉，使用的是凯杰去内毒素试剂盒提取；

3.慢病毒交付标准，滴度不低于8TU/mL；

4.文库筛选实验需根据客户具体要求寄实验实际情况进行评估。

五、优势特点

1、BI设计，公认的sgRNA评分标准、优化的设计算法批量设计sgRNA

2、可设计任意NCBI数据库中存在的物种或基因的sgRNA，可一次设计上万条sgRNAs

3、可定制特定物种全基因组文库和亚文库

4、高通量测序分析，高质检标准和丰富的生信经验

5、质粒文库构建，高覆盖度高均一性，覆盖度：≥99%

6、Oligo Pool合成，高保真性高均一性，均一性：＜8

7、质粒总量：≥500 μg（无内毒素）

8、NGS测序深度：≥300x

9、病毒包装，高滴度高质检标准

10、细胞筛选，高筛选标准和完善的筛选平台

参考文献：

[1] Konermann, Silvana, et al. "Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex." Nature 517.7536 (2015): 583-588.
[2] Wei, Jin, et al. "Genome-wide CRISPR screens reveal host factors critical for SARS-CoV-2 infection." Cell (2020).
[3]Feng Zhang et al. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Science  (2014)
[4] Hartenian E, Doench J G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology[J]. Febs Journal, 2015, 282(8):1383-1393.
[5] Shalem, O., et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-7
[6] Korkmaz, G., et al., Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol, 2016. 34(2): p. 192-8.
[7] Li, R., et al., Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering of gamma-aminobutyric acid levels in Solanum lycopersicum. Plant Biotechnol J, 2017
[8] Zhu, S., et al., Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol, 2016.34(12): p. 1279-1286.
[9] Ma, Hongming, et al. "LDLRAD3 is a receptor for Venezuelan equine encephalitis virus." Nature (2020): 1-7.